一,、目的要求 

1. 掌握微生物實驗室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法,。 2. 掌握培養(yǎng)基的配置原則和方法。 

3. 掌握高壓蒸汽滅菌的操作方法和注意事項,。 二、基本原理 

    牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基： 

是一種應用**廣泛和**普通的細菌基礎培養(yǎng)基,，有時又稱為普通培養(yǎng)基,。由于這種培養(yǎng)基中含有一般細胞生長繁殖所需要的**基本的營養(yǎng)物質(zhì)，所以可供細菌生長繁殖之用,。    高壓蒸汽滅菌： 

主要是通過升溫使蛋白質(zhì)變性從而達到殺死微生物的效果,。將滅菌的物品放在一個密閉和加壓的滅菌鍋內(nèi)，通過加熱,，使滅菌鍋內(nèi)水沸騰而產(chǎn)生蒸汽,。待蒸汽將鍋內(nèi)冷空氣從排氣閥中趨盡，關閉排氣閥繼續(xù)加熱,。此時蒸汽不溢出，壓力增大,，沸點升高,，獲得高于100℃的溫度導致菌體蛋白凝固變性，而達到滅菌的目的,。 

三,、實驗材料 

1. 藥品：牛肉膏、蛋白胨,、NaCl,、瓊脂、1mol/L的NaOH和HCl溶液,。 

2. 儀器及玻璃器皿：天平,、高壓蒸汽滅菌鍋、移液管,、試管,、燒杯、量筒,、三

角瓶,、培養(yǎng)皿、玻璃漏斗等,。 

3. 其他物品：藥匙,、稱量紙、pH試紙,、記號筆,、棉花等。 四,、操作步驟 

（一）玻璃器皿的洗滌和包裝 1．玻璃器皿的洗滌 

玻璃器皿在使用前必須洗刷干凈,。將三角瓶、試管、培養(yǎng)皿,、量筒等浸入含有洗滌劑的水中．用毛刷刷洗,，然后用自來水及蒸餾水沖凈。移液管先用含有洗滌劑的水浸泡,，再用自來水及蒸餾水沖洗,。洗刷干凈的玻璃器皿置于烘箱中烘干后備用。 

2．滅菌前玻璃器皿的包裝 

（1） 培養(yǎng)皿的包扎：培養(yǎng)皿由一蓋一底組成一套,，可用報紙將幾套培養(yǎng)皿包

成一包,，或者將幾套培養(yǎng)皿直接置于特制的鐵皮圓筒內(nèi)，加蓋滅菌,。包裝后的培養(yǎng)皿須經(jīng)滅菌之后才能使用,。 

（2） 移液管的包扎：在移液管的上端塞入一小段棉花(勿用脫脂棉)，它的作

用是避免外界及口中雜菌進入管內(nèi),，并防止菌液等吸入口中,。塞入此小段棉花應距管口約0.5cm左右，棉花自身長度約1~1.5cm,。塞棉花時．可用一外圍拉直的曲別針,、將少許棉花塞入管口內(nèi)。棉花要塞得松緊適宜,，吹時以能通氣而又不使棉花滑下為準,。 

先將報紙裁成寬約5cm左右的長紙條，然后將已塞好棉花的移液管**放在長條報紙的一端,，約成45℃角,，折疊紙條包住**，用左手握住移液管身,，有手將移液管壓緊．在桌面上向前搓轉(zhuǎn),，以螺旋式包扎起來。上端剩余紙條,，折疊打結(jié),，準備滅菌。 （二）液體及固體培養(yǎng)基的配制過程 1．液體培養(yǎng)基配制 

     （1）稱量（假定配制1000ml培養(yǎng)基） 

按培養(yǎng)基配方比例依次準確地稱取3.0g牛肉膏,、10.0 g蛋白胨,、5.0gNaCl放入燒杯（或1000ml刻度搪瓷杯）中．牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量,，用熱水溶化后倒入燒杯,。 

（2）溶化 

在上述燒杯中先加入少于所需要的水量（如約700ml），用玻棒攪勻,，然后,，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解,，將藥品完全溶解后，補充水到所需的總體積（1000ml）,；如果配制固體培養(yǎng)基時,，將稱好的瓊脂放人已溶的藥品中，再加熱溶化,，**后補足所損失的水分,。 

（3）調(diào)pH 

    調(diào)pH：一般用pH試紙測定培養(yǎng)基的pH。用剪刀剪出一小段pH試紙,，然后用鑷子夾取此段pH試紙,，在培養(yǎng)基中蘸一下，觀看其pH范圍,，如培養(yǎng)基偏酸或偏堿時,，可用1mol/L NaoH或1mol/L HCl溶液進行調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)pH時,，應逐滴加入NaOH或HCI溶液,，防止局部過酸或過堿，破壞培養(yǎng)基中成分,。邊加邊攪拌，并不時用pH試紙測試,，直**pH達7.4-7.6,。反之，用1mol／LHCl進行調(diào)節(jié),。 

2．固體培養(yǎng)基的配制 

    配制固體培養(yǎng)基時,，應將已配好的液體培養(yǎng)基加熱煮沸，再將稱好的瓊脂(1.5~2％)加 

入,，并用玻棒不斷攪拌,，以免糊底燒焦。繼續(xù)加熱**瓊脂全部融化,，**后補足因蒸發(fā)而失去水分,。 （三）培養(yǎng)基的分裝 

    根據(jù)不同需要，可將已配好培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶內(nèi),，分裝時注意不要使培養(yǎng)基沾污管口或瓶口,，造成污染。如操作不小心,，培養(yǎng)基沾污管口或瓶口時,，可用鑷子夾一小塊脫脂棉，擦去管口或瓶口的培養(yǎng)基,，并將脫脂棉棄去,。 1．試管的分裝 

取一個玻璃漏斗,，裝在鐵架上，漏斗下連一根橡皮管,，橡皮管下端再與另一玻璃管相接,，橡皮管的中部加一彈簧夾。分裝時,，用左手拿住空試管中部,，并將漏斗下的玻璃管嘴插入試管內(nèi)，以右手拇指及食指開放彈簧夾,，中指及無名指夾佐玻璃管嘴,，使培養(yǎng)基直接流入試管內(nèi)。裝入試管培養(yǎng)基的量視試管大小及需要而定,，若所用試管大小為15×150 mm時,，液體培養(yǎng)基可分裝**試管高度1／4左有為宜；如分裝固體或半固體培養(yǎng)基時,，在瓊脂完全融化后,，應趁熱分裝于試管中。用于制作斜面的固體培養(yǎng)基的分裝量為管高1／5(約3—4mI),，半固體培養(yǎng)基分裝量為管高的1／3為宜,。 2．三角瓶的分裝 

   用于振蕩培養(yǎng)微生物時，可在250 m1三角瓶中加入50 m1的液體培養(yǎng)基,；若用于制作 #p#分頁標題#e#

平板培養(yǎng)基用時,，可在250 m1三角瓶中加入150ml培養(yǎng)基，然后再加入3g瓊脂粉(按2％計算),，滅菌時瓶中瓊脂粉同時被融化,。 （四）棉塞的制作及試管、三角瓶的包扎 

    為了培養(yǎng)好氣性微生物,，需提供優(yōu)良通氣條件,，同時為防止雜菌污染，則必須對通入試管或三角瓶內(nèi)空氣預先進行過濾除菌,。通常方法是在試管及三角瓶口加上棉花塞等,。 1．試管棉塞的制作 

制棉塞時，應選用大小,、厚薄適中的普通棉花一塊,，鋪展于左手拇指和食指扣成的團孔上，用右手食指將棉花從中央壓入團孔中制成棉塞．然后直接壓入試管或三角瓶口,。也可借用玻璃棒塞入,，也可用折疊卷塞法制作棉塞。 

制作的棉塞應緊貼管壁,，不留縫隙,，以防外界微生物沿縫隙侵入,，棉塞不宜過緊或過松，塞好后以手提棉塞,，試管不下落為準,。棉塞的2／3在試管內(nèi)，1／3在試管外,。目前也有采用硅膠塞代替棉塞直接蓋在試管口上,。 

將裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或硅膠塞的試管捆成一捆，外面包上一層牛皮紙,。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱及配制日期,，滅菌待用。 2．三角瓶棉塞制作 

通常在棉塞外包上一層紗布,，再塞在瓶口上,。有時為了進行液體振蕩培養(yǎng)加大通氣量，則可用8層紗布代替棉塞包在瓶口上,，目前也有采用硅膠塞直接蓋在瓶口上,。 

在裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或包扎八層紗布或蓋好硅膠塞的三角瓶口上，再包上一層牛皮紙并用線繩捆好,，滅菌待用,。 （五）培養(yǎng)基的滅菌 

將上述培養(yǎng)基以0.103MPa，l21℃,，20min高壓蒸氣滅菌,。 滅菌過程： 

1. 加水：shou先將內(nèi)層鍋取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水,，使水面沒過加熱蛇

管，與三角擱架相平為宜,。切勿忘記檢查水位,，加水量過少，滅菌鍋會發(fā)生燒干引起炸裂事故,。 

2. 裝料：放回內(nèi)層鍋,，并裝入待滅菌的物品。注意不要裝得太擠,，以免妨礙蒸

汽流通而影響滅菌效果,。裝有培養(yǎng)基的容器放置時要防止液體溢出，三角瓶與試管口端均不要與桶壁接觸,，以免冷凝水淋濕包扎的紙而透入棉塞,。 3. 加蓋：將蓋上與排氣孔相連的排氣軟管插入內(nèi)層鍋的排氣槽內(nèi)，擺正鍋蓋,，

對齊螺口,，然后以對稱方式同時旋緊相對的兩個螺栓,，使螺栓松緊一致，勿使漏氣,，并打開排氣閥,。 

4. 排氣：打開電源加熱滅菌鍋，將水煮沸,，使鍋內(nèi)的冷空氣和水蒸汽一起從排

氣孔中排出,。一般認為當排出的氣流很強并有噓聲時，表明鍋內(nèi)的空氣已排盡,，沸騰后約需5分鐘,。 

5. 升壓：冷空氣完全排盡后，關閉排氣閥,，繼續(xù)加熱,，鍋內(nèi)壓力開始上升。 6. 保壓：當壓力表指針達到所需壓力時,，控制電源,，開始計時并維持壓力**所

需的時間。如本實驗中采用0.1Mpa,，121.5℃,，20分鐘滅菌。 

滅菌的主要因素是溫度而不是壓力,，因此鍋內(nèi)的冷空氣必須完全排盡后,，才能關閉排氣閥，維持所需壓力,。 

7. 降壓：達到滅菌所需的時間后,，切斷電源，讓滅菌鍋溫度自然下降,，當壓力

表的壓力降**“0”后,，方可打開排氣閥，排盡余下的蒸汽,，旋松螺栓,，打開鍋蓋，取出滅菌物品,，倒掉鍋內(nèi)剩水,。壓力一定要降到“0”后，才能打開排氣閥,，開蓋取物,。否則就會因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基或試劑由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出容器口,，造成瓶口被污染,，甚**灼傷操作者,。 （六）斜面和平板的制作 1．斜面的制作 

將已滅菌裝有瓊脂培養(yǎng)基的試管，趁熱置于木棒或玻棒上,，使成適當斜度,，凝固后即成斜面。斜面長度不超過試管長度l／2為宜,。如制作半團體或固體深層培養(yǎng)基時,，滅菌后則應垂直放置**凝固。 2．平板的制作 

將裝在三角瓶或試管中已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基融化后,，待冷**50℃左右傾入無菌培養(yǎng)皿中,。溫度過高時，皿蓋上的冷凝水太多,；溫度低于50℃,，培養(yǎng)基易于凝固而無法制作平板。 

平板的制作應在火旁進行,，左手拿培養(yǎng)皿,，右手拿三角瓶的底部或試管，左手同時用小指和手掌將棉塞打開,，灼燒瓶口,，用左手大拇指將培養(yǎng)皿蓋打開一縫，**瓶口正好伸入,，傾入10~15mL培養(yǎng)基,，迅速蓋好皿蓋，置于桌上,，輕輕旋轉(zhuǎn)平皿,，使培養(yǎng)基均勻分布于整個平皿中，冷凝后即成平板,。 （七）培養(yǎng)基的滅菌檢查 

滅菌后的培養(yǎng)基,，一般需進行無菌檢查。**好取出1~2管(瓶),，置于37℃溫箱中培養(yǎng)1~2天,，確定無菌后方可使用,。